8 (812) 318-50-90
8 (800) 555-777-9

Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия

Люминесцентные микроскопы

  Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия основана на способности некоторых веществ люминесцировать, т. е. светиться при освещении невидимым ультрафиолетовым или синим светом.


Цвет люминесценции смещен в более длинноволновую часть спектра по сравнению с возбуждающим ее светом (правило Стокса). При возбуждении люминесценции синим светом цвет ее может быть от зеленого до красного, если люминесценция возбуждается ультрафиолетовым излучением, то свечение может быть в любой части видимого спектра. Эта особенность люминесценции позволяет, используя специальные светофильтры, поглощающие возбуждающий свет, наблюдать сравнительно слабое люминесцентное свечение.


Устройство люминесцентного микроскопа и правила работы с ним отличаются от микроскопа проходящего света  следующим:
• Наличие мощного источника света в осветителе, изучающего преимущественно в коротковолновой (ультрафиолетовой, синей) части спектра (ртутно-кварцевая лампа сверхвысокого давления или галогенная кварцевая лампа).


• Наличие системы светофильтров:
1. возбуждающие светофильтры пропускают только ту часть спектра, которая возбуждает люминесценцию;
2. теплозащитный светофильтр защищает от перегрева другие светофильтры, препарат и оптику люминесцентного микроскопа.
3. «запирающие» светофильтры расположены между окуляром. Эти светофильтры поглощают возбуждающее излучение и пропускают свет люминесценции от препарата к глазу наблюдателя.


Оптика объективов люминесцентного микроскопа изготавливается из нелюминесцирующих сортов оптического стекла и склеивается специальным нелюминесцирующим клеем. При работе с объективами масляной иммерсии используется нелюминесцирующее иммерсионное масло.


Поскольку большинство микроорганизмов не обладают собственной люминесценцией, существует несколько способов их обработки для наблюдения в люминесцентном микроскопе. Прежде всего это флюорохромирование - окрашивание сильно разведенными (до нескольких микрограмм/мл) растворами флюоресцирующих красителей (флюорохромов). Этот метод используется для бактериоскопического исследования возбудителей некоторых инфекций: туберкулеза (ауромин),, включений в клетках, образуемых некоторыми вирусами и др. Этот же способ может применяться для цитохимического изучения живых и фиксированных микроорганизмов: некоторые флюорохромы избирательно связываются с полимерами клетки (акридиновый оранжевый связываясь с ДНК флюоресцирует зеленым, а с РНК - красным.
В реакции иммуннофлюоресценции с помощью антител, меченных флюорохромами (ФИТЦ и др.), выявляются антигены микроорганизмов или антитела в сыворотке больных.


Во флуоресцентной микроскопии используются два способа освещения препарата: проходящим светом и падающим, светом.

Освещение проходящим светом


Конденсор фокусирует возбуждающий свет в поле зрения микроскопа. Испускаемая флуоресценция собирается объективом и наблюдается с помощью окуляров. При такой конфигурации прибора достаточно двух линз: с помощью одной (конденсор) фокусируется возбуждающий свет, с помощью другой (объектив) собирается испускаемый свет. Для получения оптимальных условий наблюдения две эти линзы, имеющие собственные оптические оси, должны быть хорошо отъюстированы. Достичь точной юстировки и затем поддерживать ее при постоянной работе не так просто.


 Недостатком освещения проходящим светом является то, что при освещении светлопольным конденсором практически весь возбуждающий свет попадает в объектив. Поскольку интенсивность возбуждающего света часто на несколько порядков выше интенсивности света флуоресценции, то для их разделения требуются фильтры очень высокого качества. Чтобы избежать этой проблемы, можно воспользоваться темнопольным конденсором, который освещает препарат под таким углом, что никакой прямой возбуждающий свет не попадает в объектив. Это содействует разделению возбуждающего света и света флуоресценции, которое в основном производится с помощью запирающих светофильтров. Но, с другой стороны, темнопольные конденсоры пропускают намного меньше возбуждающего света, чем светлопольные конденсоры. В случае применения проходящего света в сочетании с объективами большой оптической силы требуется помещать между конденсором и предметным стеклом иммерсионное масло, что также создает неудобства при постоянной работе. Недостатком освещения проходящим светом является и то, что трудно совмещать флуоресценцию с фазовым контрастом или светлопольной микроскопией.

Освещение падающим светом

Для фокусировки возбуждающего света на препарат и собирания испускаемого флуоресцирующим препаратом света используется только одна линза — объектив. Для отделения испускаемого света флуоресценции от непоглощенного возбуждающего света используется зеркало специального типа — цветное светоделительное зеркало (дихроичное зеркало), которое располагается при флуоресцентной микроскопии на пути падающего света над объективом. Эти зеркала имеют специальное интерференционное покрытие, которое отражает на препарат свет, длина волны которого меньше определенного значения, и пропускает более длинноволновый свет флуоресценции в окуляры. Более того, возбуждающий свет, отраженный от препарата или от оптических деталей микроскопа и идущий в окуляры, эффективно отражается дихроичным зеркалом и не попадает, таким образом, в окуляры. Таким образом,  цветное светоделительное зеркало работает и как возбуждающий, и как запирающий фильтр, но на практике нужен дополнительный запирающий фильтр для того, чтобы удалить остатки возбуждающего света.


Преимуществом зпиосвещения является то, что одна и та же система работает и как конденсор, и как объектив. Таким образом, фокусируя данный объектив на препарате, вы одновременно получаете правильную настройку всей данной части микроскопа. Освещаемое поле является полем зрения. При использовании масляно-иммерсионного объектива достаточно нанести масло на препарат, тогда как при работе в проходящем свете для получения максимальной интенсивности освещения необходимо еще нанести масло на высокоапертурный конденсор. Кроме того, эпиосвещение позволяет легко переходить от флуоресцентной микроскопии к микроскопии в проходящем свете, так как нижнее освещение остается легкодоступным. Последнее обстоятельство в ряде случаев имеет большое значение, например при использовании иммунофлуоресценции в сочетании с фазово-контрастной микроскопией.